Потеря METTL3 в стволовых клетках мыши включает транспозоны и гены 2-клеточного состояния

Исследователи сообщили в Cell Regeneration, что нокаут Mettl3 в эмбриональных стволовых клетках мыши (mESC) приводит к широкому повышению экспрессии транспозонов (TE) и генов 2-клеточного (2C) типа. Эффект зависит от ферментативной активности m6A и не зависит от условий культивирования biomedcentral.comCell Regenerationbiomedcentral.comОткрыть источник ↗.

В экспериментах с эмбриональными химерами и временной деградацией METTL3 (система dTAG) клетки mESC с дефицитом METTL3 вносили вклад в линии трофэктодермы на стадии бластоцисты. Авторы трактуют это как расширенный потенциал развития и связывают потерю m6A с 2C-подобным состоянием с признаками расширенной потентности.

Дизайн нокаута и условия культивирования

METTL3 — каталитическое ядро комплекса, который ставит m6A на матричную РНК. Команда с помощью CRISPR-Cas9 вырезала экзоны 4 through 7 эндогенного локуса Mettl3, удалив каталитический мотив DPPW в экзоне 6. Делеция вызвала сдвиг рамки считывания, иммуноблоттинг не выявил белок METTL3. По данным масс-спектрометрии, отношение m6A к аденозину в очищенной мРНК упало до практически неопределяемого уровня.

Авторы сравнили клетки дикого типа и нокаутные в трёх средах: сыворотка с фактором ингибирования лейкемии, бессывороточная среда N2B27 с двумя низкомолекулярными ингибиторами и тем же фактором, и сыворотка с обоими ингибиторами. В сыворотке без ингибиторов нокаутные клетки растекались веретеновидным монослоем и не формировали колонии. В бессывороточной среде с ингибиторами киназы гликогенсинтазы 3 и MEK они образовывали уплощённые колониеподобные структуры. Потеря m6A в мРНК во всех средах была одинаковой biomedcentral.comCell Regenerationbiomedcentral.comОткрыть источник ↗.

Транспозоны и каталитическая активность

Количественная ПЦР и bulk RNA-секвенирование показали, что TE были дерепрессированы в клетках с дефицитом METTL3 и в сыворотке, и в химически определённых средах. Транскрипты семейств LINE-1 и внутрицистернальных A-частиц были выше, чем в контроле дикого типа.

В экспериментах по восстановлению полноразмерный METTL3 дикого типа возвращал уровни транскриптов ретротранспозонов к исходным. Каталитически неактивный мутант, в котором DPPW заменён на APPA в аминокислотах 395 through 398, репрессию не восстанавливал. Не восстанавливал её и укороченный вариант, охватывающий аминокислоты 242 through 448, без домена цинкового пальца и каталитического ядра. Авторы делают вывод, что репрессия TE в mESC зависит от каталитической активности METTL3.

Ранее исследования расходились в том, как потеря METTL3 влияет на подвижные элементы, включая направление изменений для элементов LINE в разных составах сред. Чтобы отделить синтез новых транскриптов от изменённого распада неметилированной РНК, авторы применили DRB-чейз в сочетании с секвенированием транзиентного транскриптома (DRB-TT-seq) biomedcentral.comCell Regenerationbiomedcentral.comОткрыть источник ↗.