Пекинский университет химтехнологии: E. coli даёт 13,46 г/л денцихина в 3-литровых биореакторах

Группа Пекинского университета химических технологий создала штамм Escherichia coli, который синтезирует денцихин (β-ODAP), кровоостанавливающее вещество растительного происхождения: 13,46 г/л при выходе 0,32 г/г в биореакторах на 3 л. Работа опубликована в The Innovation Life; по словам авторов, это самый высокий из описанных титров для данного соединения doi.orgThe Innovation Lifedoi.orgОткрыть источник ↗. Результат получен на лабораторном штамме в малом масштабе; масштабирование за пределы 3 л ещё впереди.

Денцихин содержится в Panax notoginseng и также проявляет нейропротекторную активность. Извлечение из растений медленное и малоэффективное, поэтому его синтез перенесли в E. coli; первая попытка остановилась на 1,29 г/л.

Дефект роста и токсичный побочный продукт

Команда выбрала путь расщепления оксалоацетата с помощью анализа баланса потоков. Многокопийная интеграция ключевых генов и делеция serB подняли содержание предшественника L-2,3-диаминопропионата до 3,07 г/л. Настройка двух ацилтрансферазных стадий, ScAAE и LsBAHD, добавила ещё 223%, а балансировка узла ФЕП–ОАА–пируват довела титр до 2,3 г/л.

После этого рост клеток упал. Нокаут serB блокирует конкурирующий путь L-серина и делает клетки зависимыми от него, но добавление L-серина или L-глицина восстановило рост лишь частично doi.orgThe Innovation Lifedoi.orgОткрыть источник ↗. Адаптивная лабораторная эволюция ослабленного штамма дала линии с мутациями в glpK и serA. Обратная инженерия показала, что сверхэкспрессия serA, обеспечивающая предшественник, приводит к тому, что 3-фосфоглицератдегидрогеназа превращает α-кетоглутарат в токсичный побочный продукт 2-гидроксиглутарат (2-HG).

Двойная динамическая схема и баланс кофакторов

Чтобы снять оба ограничения, авторы построили схему, зависящую от фазы роста и не требующую внешнего индуктора. Она постепенно включает serA и постепенно подавляет serB по мере входа клеток в стационарную фазу, что снижает накопление 2-HG и смягчает зависимость от серина. Полученный штамм ODAP28 снизил токсин до следовых уровней и дал 4,43 г/л при в основном восстановленной биомассе.

Путь также создаёт избыток NADH. Команда ввела NADH-зависимую глутаматдегидрогеназу BsuRocG, создав цикл рециркуляции кофактора: он снижает отношение NADH/NAD+ и поставляет глутамат как субстрат. Итоговый штамм ODAP32 дал 13,46 г/л.

Авторы считают, что подход может подойти и для других продуктов серинового пути, например L-цистеина и L-триптофана. Они отмечают, что механизм остановки роста под действием 2-HG и возможность повысить отзывчивость схемы остаются открытыми вопросами doi.orgThe Innovation Lifedoi.orgОткрыть источник ↗.