Инженерная E. coli дала 102,18 г/л 3′-сиаллактозы в биореакторе на 5 л

Исследователи описали в журнале Bioresources and Bioprocessing инженерный штамм Escherichia coli BL21(DE3), который синтезировал 3′-сиаллактозу (3′-SL) в концентрации 102,18 г/л в биореакторе на 5 л в режиме fed-batch и 7,75 г/л в колбах. По сведениям авторов, это самый высокий из известных на сегодня уровней biomedcentral.comBioresources and Bioprocessingbiomedcentral.comОткрыть источник ↗. В штамме нет плазмид и антибиотических маркеров.

3′-SL — простейший сиалированный олигосахарид грудного молока. Его широко добавляют в детские смеси из-за роли в формировании кишечной микробиоты, подавлении адгезии патогенов и поддержке развития нервной системы.

Скрининг сиалилтрансферазы и поток углерода

Исходный хозяин, мутант SLEB01, нёс делеции генов lacZ, nanA, nanKE и nagABE: они блокируют расщепление лактозы, катаболизм сиаловой кислоты и распад аминосахаров. Для пути нужны neuC, neuB, neuA и α-2,3-сиалилтрансфераза. При сравнении в колбах за 48 часов фермент из Bibersteinia trehalosi дал 1,78 г/л, а эталонный фермент из Neisseria meningitidis — 1,45 г/л. Идентичность аминокислотных последовательностей двух ферментов составляет 14,87 процента.

Делеция pfkA с помощью CRISPR-Cas9 снизила биомассу клеток на 8,5 процента, но подняла титр на 58,4 процента, до 2,82 г/л. Сверхэкспрессия гена пермеазы лактозы lacY дала 3,20 г/л, а сочетание обеих модификаций в штамме S11 — 3,64 г/л. Совместная сверхэкспрессия fbaA и фруктозо-1,6-бисфосфатазы подняла титр до 4,11 г/л без снижения биомассы biomedcentral.comBioresources and Bioprocessingbiomedcentral.comОткрыть источник ↗.

Настройка промоторов и многокопийная интеграция

Кроме того, оптимизировали экспрессию ключевых ферментов биосинтеза UDP-GlcNAc и CMP-Neu5Ac, чтобы увеличить пул предшественников. Затем с помощью промоторной инженерии сбалансировали экспрессию четырёх генов: neuA, neuB, neuC и гена сиалилтрансферазы ST.

Оптимизированную многогенную кассету интегрировали в хромосому за один шаг по многокопийной стратегии. Так получили штамм без плазмид и антибиотических маркеров, давший указанные выше титры в колбах и биореакторе.

Авторы называют этот подход, сочетающий перестройку метаболизма, адаптивную настройку экспрессии генов и многокопийную интеграцию в геном, платформой для получения 3′-SL и других ценных олигосахаридов грудного молока biomedcentral.comBioresources and Bioprocessingbiomedcentral.comОткрыть источник ↗. Результаты получены при лабораторном культивировании.