Векторы CRISPR-Cpf1 доставляют до десяти гидовых РНК и дают тройную делецию генов у Aspergillus niger за две недели

Исследовательская группа описала набор инструментов CRISPR-Cas12a (Cpf1) для мультиплексного редактирования генома нитчатого гриба Aspergillus niger. По данным журнала «Fungal Biology and Biotechnology», плазмиды способны доставлять до десяти гидовых РНК (gRNA), а три гена удалили одновременно без предварительной проверки gRNA и без интегрированных в геном маркеров отбора biomedcentral.comFungal Biology and Biotechnologybiomedcentral.comОткрыть источник ↗. Авторы сообщают, что несколько модификаций выполняются менее чем за две недели.

Виды Aspergillus используются в промышленности более века: для пищевых ферментаций, получения лимонной кислоты и ферментов, например амилаз. Создание эффективных грибных клеточных фабрик требует множества штаммоспецифичных модификаций, а традиционные схемы опираются на последовательные раунды трансформации и рециклинг маркеров, из-за чего проекты могут растягиваться на годы.

Почему Cpf1 упрощает доставку гидов

В отличие от Cas9, Cpf1 высвобождает несколько gRNA из одной РНК-предшественницы с помощью собственной РНКазной активности. Он узнаёт и разрезает консервативную шпильку из 14–16 нуклеотидов внутри повтора crRNA длиной 19–20 нуклеотидов. Это устраняет необходимость в рибозимах и элементах процессинга тРНК, чьи повторяющиеся последовательности в грибах усложняют сборку плазмид и могут вызывать нестабильность из-за рекомбинации прямых повторов. Кроме того, каждый локус можно нацелить несколькими gRNA, повышая вероятность разрыва ДНК.

Плазмиды содержат последовательность AMA1 для внехромосомной репликации и четыре маркера отбора: pyrG, argB, hph и ble. Cpf1 кодируется кодон-оптимизированным геном бактерии Lachnospiraceae с сигналом ядерной локализации. Кассета гидов экспрессируется с промотора U3 Aspergillus fumigatus и собирается методом USER-клонирования из ПЦР-фрагментов и синтетических двухцепочечных олигонуклеотидов, названных bio-blocks. Кассеты с девятью–десятью гидами подтвердили колониальной ПЦР и секвенированием по Сэнгеру после скрининга пяти–десяти бактериальных трансформантов.

Тройные делеции в штамме NIG159

Редактирование проверяли в штамме NIG159 с делецией kusA, который не способен репарировать двунитевые разрывы негомологичным соединением концов. Без донорных матриц клетки не выживали, что подтвердило активность нуклеаз, высвобождаемых векторами. Донорные субстраты с плечами гомологии по 500 пар оснований использовали, чтобы одновременно вырезать около 300 пар оснований вокруг стартового кодона трёх генов. Каждый ген нацеливали тремя неохарактеризованными gRNA, полагаясь на избыточность, а не на предварительную проверку.

В первом эксперименте, Gene Set 1, три неохарактеризованных гена (A, B и C) нацеливали с помощью плазмиды pCpf1.MEC1 с маркером pyrG. Авторы заключают, что система эффективна для построения векторов CRISPR-Cpf1 со множеством gRNA, и ожидают значительного ускорения создания клеточных фабрик biomedcentral.comFungal Biology and Biotechnologybiomedcentral.comОткрыть источник ↗.