KTH проверил 15 000 вариантов бактериального рубиско в цианобактерии: полезные замены плохо суммируются
Варианты рубиско Gallionella проверили в живых клетках Synechocystis: полезные замены по отдельности часто теряли эффект в сочетании. Данные получены на бактериях, не на растениях.
Группа под руководством Пола Хадсона из Королевского технологического института KTH в Стокгольме проверила около 15 000 вариантов бактериального рубиско в живых фотосинтезирующих клетках. Результаты опубликованы в Science Advances. Использовали рубиско формы II из Gallionella sp., хозяином служила цианобактерия Synechocystis sp. PCC 6803 science.org
Science Advancesscience.orgОткрыть источник ↗.
Рубиско захватывает углекислый газ при фотосинтезе, но реагирует и с кислородом, что обходится клетке в энергию. Быстрые бактериальные формы менее избирательны к углекислому газу. Авторы стремились сделать такие ферменты ещё быстрее или снизить оксигенацию, сохранив высокую карбоксилирующую активность.
Скрининг, связанный с ростом
Собственное рубиско клеток было почти полностью отключено, поэтому скорость роста зависела от введённого фермента. Каждый вариант нёс ДНК-штрихкод, что позволяло отслеживать варианты в общей культуре. Библиотека включала варианты с одиночными и множественными заменами.
Замены, повышавшие приспособленность, группировались в петле 6 возле активного центра, на границе димера и в возможных газовых туннелях science.org
Science Advancesscience.orgОткрыть источник ↗. По данным пересказа работы, около 8% вариантов с одиночной заменой росли лучше исходного фермента, среди вариантов с множеством замен — менее 1%. Один короткий участок-спираль у входа для субстрата не допускал изменений: любая замена там снижала рост.
Комбинации и модели
Сочетание лучших замен в основном не сработало: в среднем чем больше изменений нёс вариант, тем хуже росли клетки. В наборе данных есть примеры эпистаза, и, как отмечают авторы, он пригоден для проверки вычислительных моделей рубиско. Из 11 новых вариантов, предложенных моделью, обученной на этих данных, восемь не поддерживали рост, два превзошли исходный фермент. Лучший вариант, Ad1, получен простым сложением проверенных замен.
In vitro Ad1 и шестизамещённый вариант C6 показали сниженную каталитическую эффективность оксигенации (kcat/Ko). У одного из них вырос оборот карбоксилирования (kcat C). По данным пересказа, C6 был примерно на 25% быстрее исходного фермента, Ad1 — примерно на 15% медленнее. Обоим для полной скорости требовалось больше углекислого газа.
Ограничения
Работа выполнена на цианобактериях с бактериальным ферментом, поэтому для применения в культурных растениях нужны проверки в растительных клетках и целых растениях. Скрининг шёл при 5% углекислого газа, намного выше уровня в воздухе, а подробно охарактеризованы лишь два фермента. Сейчас группа испытывает новые ферменты в растительных клетках и в цианобактериях, модифицированных для синтеза химических веществ.
