Неупорядоченный N-конец Rpl8A дрожжей защищает слитые белки от котрансляционной деградации
В дрожжах первые 50 остатков Rpl8A действуют как переносимый стабилизатор, хотя неупорядоченные участки считали мишенью протеолиза. Эффект описан и в клетках человека.
Исследователи на дрожжах Saccharomyces cerevisiae показали, что первые 50 аминокислот рибосомного белка Rpl8A, внутренне неупорядоченный участок, подавляют котрансляционную деградацию белка (CTPD), а не усиливают её, говорится в статье на doi.org nature.com
doi.orgnature.comОткрыть источник ↗. Авторы также сообщают, что неупорядоченные N-концевые фрагменты работают как стабилизирующие элементы в культивируемых эмбриональных клетках почки человека. Результат противоречит распространённому представлению, что неструктурированные участки служат точкой входа для протеолиза.
Где находится дегрон
Ранее та же группа поместила дегрон, направляющий CTPD белка Rpl8A, в N-концевые 100 остатков. После синтеза Rpl8A стабилен, поэтому в зрелом белке дегрон должен быть экранирован. Мутант без C-концевых остатков 201–256 нестабилен после синтеза, что указывает на маскировку дегрона C-концевой областью. Предсказание структуры показало, что остатки 1–50 неупорядочены, а остатки 51–100 образуют две спирали, контактирующие с C-концевыми доменами, в том числе с остатками 234, 236 и 237.
Чтобы проверить каждый участок, авторы присоединили фрагменты к N-концу мышиной дигидрофолатредуктазы (DHFR) с C-концевой HA-меткой и провели хейз с циклогексимидом. Rpl8A 1–50-DHFRha был так же стабилен, как DHFRha, тогда как Rpl8A 51–100-DHFRha быстро разрушался, как и слитый белок с фрагментом 1–100. Уровни транскриптов конструкций были сопоставимы, поэтому разница в содержании белков не связана с транскрипцией. Значит, дегрон расположен в остатках 51–100, а не в неупорядоченном сегменте 1–50.
Переносимый стабилизатор
Стационарный уровень Rpl8A 1–50-DHFRha был намного выше, чем у DHFRha. Мышиная DHFR стабильна после синтеза, но в дрожжах разрушается котрансляционно, поэтому добавленный сегмент подавляет CTPD nature.com
doi.orgnature.comОткрыть источник ↗. Его уровень совпал с уровнем DHFRha, высвобождаемой из предшественника убиквитин-DHFR, что говорит о силе, близкой к N-концевому убиквитину.
То же наблюдали для рибосомного белка Rps31, который клетки в норме синтезируют как слияние с убиквитином. Rpl8A 1–50-Rps31ha накапливался на заметно более высоком уровне, чем Rps31ha, синтезированный без N-концевого убиквитина, при сопоставимых уровнях транскриптов.
Удаление остатков 1–50 из Rpl8A снизило стационарный уровень Rpl8A Δ1–50ha примерно до 50% от уровня Rpl8Aha. Мутант был так же стабилен, как полноразмерный белок, в хейзе, а его транскрипт не уменьшился, то есть делеция не вызвала деградацию после синтеза. Авторы заключают, что Rpl8A 1–50 — стабилизатор, препятствующий CTPD белка Rpl8A, который можно переносить на другие белки, помещая его на их N-конец. Все эксперименты выполнены на культивируемых клетках.
