Скрининг РНК-связывающих белков в клетках HEK 293T выявил 68 активаторов трансляции кольцевых РНК

Исследователи сообщили в Nature Communications о систематическом скрининге РНК-связывающих белков (RBP), усиливающих трансляцию кольцевых РНК (circRNA) в клетках человека. Скрининг выявил 68 белков как предполагаемые активаторы неканонической трансляции doi.orgNature Communicationsdoi.orgОткрыть источник ↗. Работа выполнена в клетках HEK 293T, анализ проводили через 36 часов после трансфекции.

CircRNA — замкнутые одноцепочечные молекулы, которые могут транслироваться в белки и, по данным авторов, стабильнее линейной мРНК. Хорошо очищенные circRNA к тому же обладают меньшей иммуногенностью даже без модификации оснований, поэтому их рассматривают для РНК-терапии doi.orgNature Communicationsdoi.orgОткрыть источник ↗. Их трансляция в основном управляется участками внутренней посадки рибосомы (IRES) и регулируется RBP, известными как IRES-транс-действующие факторы. Однако эффективность IRES-зависимой трансляции в целом низкая, а факторы, усиливающие её в circRNA, изучены недостаточно doi.orgNature Communicationsdoi.orgОткрыть источник ↗.

Репортёрная система и скрининг

Авторы создали люминесцентный репортёр. Кодирующую последовательность люциферазы светляка разделили на два фрагмента в обратном порядке, окружённых интронами с комплементарными элементами. Бэк-сплайсинг даёт кольцевую РНК с целой рамкой считывания, поэтому сигнал отражает трансляцию circRNA, а не линейной мРНК. Ген люциферазы Renilla служил контролем трансфекции doi.orgNature Communicationsdoi.orgОткрыть источник ↗.

Белки-кандидаты «привязывали» к circRNA через модифицированный PUF-домен, который связывает 8-нуклеотидную последовательность UUGAUAUA. Два тандемных сайта связывания расположены между стартовым и стоп-кодонами репортёра. Результаты нормировали на контроль, где PUF-домен слит только с FLAG-меткой. Систему проверили на факторах инициации трансляции eIF4E и eIF4G2 doi.orgNature Communicationsdoi.orgОткрыть источник ↗.

Активаторы и предсказание

Обнаруженные 68 активаторов участвуют в процессинге РНК, биогенезе рибосом и инициации трансляции doi.orgNature Communicationsdoi.orgОткрыть источник ↗. По данным авторов, многие из протестированных RBP стимулировали неканоническую трансляцию при посадке на circRNA. Если встроить в circRNA их родственные мотивы связывания, можно привлечь соответствующие эндогенные факторы и запустить её трансляцию doi.orgNature Communicationsdoi.orgОткрыть источник ↗.

Команда также обучила вычислительную модель на экспериментально проверенных белках, чтобы выделить общие признаки последовательностей и предсказать дополнительные активаторы среди всех известных RBP. Как новые, так и предсказанные белки усиливали IRES-опосредованную трансляцию circRNA, причём в зависимости от контекста doi.orgNature Communicationsdoi.orgОткрыть источник ↗. Авторы предполагают, что эти белки могут быть новыми IRES-транс-действующими факторами для конкретных IRES и расширяют набор инженерных RBP для синтетической биологии РНК doi.orgNature Communicationsdoi.orgОткрыть источник ↗. Данные получены на культивируемых клетках.