EVdesign дал свыше 400 активных PET-гидролаз с 12–68 заменами из 603 проверенных дизайнов

Исследовательская группа сообщила в Nature Communications о сочетании эволюционного дизайна (EVdesign) и рационального дизайна для создания улучшенных гидролаз полиэтилентерефталата (PET), ферментов, деполимеризующих PET doi.orgNature Communicationsdoi.orgОткрыть источник ↗. Всего авторы экспериментально проверили 603 дизайна, полученных из восьми родительских PETаз. Более 400 вариантов с 12–68 аминокислотными заменами деполимеризовали PET, почти все превзошли родительские ферменты, а многие приблизились к эталону LCC-ICCG в тестах частичной конверсии doi.orgNature Communicationsdoi.orgОткрыть источник ↗.

Ферментативная деполимеризация рассматривается как путь переработки PET до мономеров. По данным авторов, промышленному применению мешают необходимость контроля pH и низкая активность на PET с высокой кристалличностью doi.orgNature Communicationsdoi.orgОткрыть источник ↗. Прежняя инженерия PETаз в основном опиралась на рациональный дизайн, поиск природных ферментов или направленную эволюцию, и каждый подход вносил за раз сравнительно мало мутаций doi.orgNature Communicationsdoi.orgОткрыть источник ↗.

Как работает EVdesign

EVdesign использует закономерности совместной изменчивости аминокислот в множественных выравниваниях гомологичных белков, описанные методом EVcouplings, чтобы предлагать согласованные наборы мутаций, которые не должны нарушать структуру и активность doi.orgNature Communicationsdoi.orgОткрыть источник ↗. Варианты получали и тестировали в высокопроизводительном конвейере: полуавтоматическая платформа экспрессии и очистки с роботом для работы с жидкостями. Термостабильность и гидролиз PET оценивали на аморфном и кристаллическом PET, при разных pH и температурах doi.orgNature Communicationsdoi.orgОткрыть источник ↗.

Выбор каркаса и итерации

Дизайны на основе разных родительских ферментов сильно различались по доле успешных вариантов и по активности. Наиболее подходящим для дизайна каркасом оказался TfCut2 из Thermobifida fusca doi.orgNature Communicationsdoi.orgОткрыть источник ↗. Рост разнообразия последовательностей уменьшал число активных ферментов, но расширял разброс показателей, что позволило находить варианты с выдающейся активностью doi.orgNature Communicationsdoi.orgОткрыть источник ↗.

Четыре рациональные мутации устранили ограничение по термостабильности у TfCut2. Этот вариант использовали как каркас для итеративного EVdesign, который ещё повысил активность doi.orgNature Communicationsdoi.orgОткрыть источник ↗. Данные получены в лабораторных тестах с очищенными ферментами; авторы называют EVdesign надёжной стратегией получения разнообразных высокоактивных ферментов doi.orgNature Communicationsdoi.orgОткрыть источник ↗.