Платформа dual-sgRNA CRISPRi построила карты взаимодействий жизненно важных генов M. tuberculosis

Исследователи разработали платформу dual-sgRNA CRISPR-интерференции (CRISPRi) для высокопроизводительного картирования генетических взаимодействий (GI) у микобактерий. С её помощью они построили карты взаимодействий жизненно важных генов Mycobacterium smegmatis и Mycobacterium tuberculosis, сообщается в статье в Nature doi.orgNaturedoi.orgОткрыть источник ↗. Туберкулёз остаётся ведущей инфекционной причиной смерти в мире, а многие гены M. tuberculosis до сих пор плохо охарактеризованы doi.orgNaturedoi.orgОткрыть источник ↗.

Платформа и дизайн библиотеки

GI — это комбинированный фенотип, отклоняющийся от ожидаемого по эффектам отдельных генов. Отрицательные взаимодействия, включая синтетическую летальность, дают более тяжёлый фенотип, положительные — более мягкий doi.orgNaturedoi.orgОткрыть источник ↗. Авторы адаптировали подход CombiGEM к платформе CRISPRi для M. tuberculosis и присвоили каждой sgRNA баркод, так что численность штаммов с двумя sgRNA определяется секвенированием баркодов doi.orgNaturedoi.orgОткрыть источник ↗.

Пилотный скрининг на M. smegmatis включал 16 генов, для которых предсказано взаимодействие, и до 24 sgRNA на ген. Он определил силу sgRNA, оптимальную для выявления GI: снижение приспособленности примерно на 8% за поколение doi.orgNaturedoi.orgОткрыть источник ↗. Исходя из этого, команда собрала библиотеку из 1524 sgRNA, нацеленных на 787 генов, плюс 10 контролей без мишени, что даёт около 2,3 млн комбинаций sgRNA. Мишени включали гены, жизненно важные для M. smegmatis, и гены, которые у неё не являются жизненно важными, но важны для M. tuberculosis doi.orgNaturedoi.orgОткрыть источник ↗.

Карты взаимодействий и проверка

Карты охватывают почти все жизненно важные гены обоих видов. Они воспроизводят известные биологические связи и, по данным авторов, выявляют тысячи ранее не описанных взаимодействий и функциональные связи между жизненно важными генами и мишенями лекарств doi.orgNaturedoi.orgОткрыть источник ↗.

Для примерно 600 000 пар генов из карт авторы получили предсказания белок-белковых взаимодействий методом компьютерного ко-фолдинга. По их данным, часть GI, вероятно, отражает физические ассоциации белков doi.orgNaturedoi.orgОткрыть источник ↗.

Отдельные результаты проверили экспериментально. Проверка касалась взаимодействий между препаратами и роли в электрон-транспортной цепи нескольких генов с неизвестной функцией. Авторы сообщают, что она подтвердила новые биологические связи и возможности синергичного воздействия doi.orgNaturedoi.orgОткрыть источник ↗. Работа выполнена на бактериальных культурах. Авторы описывают её как универсальный подход к двойному возмущению генов и ресурс для рационального проектирования комбинированной терапии doi.orgNaturedoi.orgОткрыть источник ↗.