CRISPR-делеции генов CBF у арабидопсиса: для холодостойкости нужны две-три копии
Авторы удалили от одного до трёх генов CBF в линиях Arabidopsis thaliana с помощью CRISPR/Cas9; потеря двух или трёх копий резко снижала холодостойкость после акклиматизации.
Биологи растений сообщили в журнале Development Genes and Evolution, что делеции генов с помощью CRISPR/Cas9 позволяют изучать тандемно расположенные гены CBF, участвующие в холодовой акклиматизации Arabidopsis thaliana springer.com
Development Genes and Evolutionspringer.comОткрыть источник ↗. Исследователи получили линии без T-DNA, у которых отсутствовали один, два или все три гена CBF, на фонах Col-0, Cvi-0 и Bur-0 и проверили их холодостойкость после акклиматизации. Кластер CBF расположен на хромосоме 4.
Тандемные массивы генов чаще других представлены среди дубликатов, вовлечённых в ответ на стресс, но их плотное расположение в геноме затрудняло получение целевых одиночных и множественных мутантов. Прежние работы с РНК-интерференцией или точечными мутациями давали частичное подавление генов или противоречивые результаты для двойных мутантов.
Делеционные линии и частота их получения
Авторы подобрали четыре направляющие РНК по выравниванию последовательностей семи природных линий арабидопсиса из проекта 1001 Genomes. Векторы с двумя кассетами направляющих РНК и флуоресцентным маркером DsRed для отбора семян вводили методом погружения цветков. Последовательным самоопылением и ПЦР-генотипированием удалось выделить гомозиготные линии без вектора с одиночными делециями CBF1, CBF2 и CBF3, двойными делециями CBF1 с CBF3 или CBF2 с CBF3, а также тройные делеции.
Частота получения зависела от фона и вида делеции. Гомозиготные тройные делеции без вектора составили 1,2 процента потомства у Col-0, а среди 1023 проверенных растений Cvi-0 их не оказалось. Тестовые скрещивания показали обычное менделевское расщепление, поэтому авторы объясняют различия динамикой расщепления парой направляющих РНК, а не гаметофитной летальностью.
Выживаемость при заморозке и экспрессия генов
Акклиматизированные проростки Col-0 подвергали заморозке в течение двух суток при минус 5 и минус 7 градусах Цельсия. При минус 5 одиночные делеции CBF2 и CBF3 умеренно, но достоверно снижали выживаемость, а делеция одного CBF1 не отличалась от дикого типа springer.com
Development Genes and Evolutionspringer.comОткрыть источник ↗. При минус 7 линии с тройной делецией не выжили, а двойные делеции, сохранявшие только CBF1, сохранили около 10 процентов жизнеспособности.
У дикого типа Col-0 транскрипты CBF достигали максимума через два часа после переноса на 4 градуса Цельсия и к восьми часам снижались к исходному уровню. Большинство делеций слабо влияло на экспрессию оставшихся копий CBF; исключением стала двойная делеция CBF1 и CBF3, при которой уровень CBF2 оставался повышенным после двух часов. Экспрессия пяти генов, регулируемых холодом, резко снижалась в линиях без CBF2 и CBF3 или без всех трёх генов. По данным авторов, для сильного падения холодостойкости нужно отсутствие двух или трёх генов CBF, а результаты противоречат прежней гипотезе о взаимной регуляции внутри кластера.
