АСМ на стекле с глутаральдегидом показала оболочки живых бактерий с нанометровым разрешением
Авторы описали обратимое ковалентное закрепление живых бактерий для атомно-силовой микроскопии. Клетки остаются жизнеспособными и растут, включая гладкий E. coli и Pseudomonas aeruginosa.
В журнале Nature Communications описан способ закрепления живых бактерий на стекле для атомно-силовой микроскопии (АСМ). Он даёт изображения клеточной оболочки с нанометровым разрешением у нескольких видов и при разной ориентации клеток, включая полюса nature.com
Nature Communicationsnature.comОткрыть источник ↗. Метод использует покровные стёкла, функционализированные глутаральдегидом, для обратимого ковалентного прикрепления. По данным авторов, он сохраняет жизнеспособность клеток и их рост.
Почему закрепление ограничивает АСМ
АСМ дала изображения нативных оболочек бактерий с самым высоким разрешением, но требует жёсткого закрепления клеток без их повреждения. Ранее применяли физический захват в сетках или канавках, химическое сцепление, гидрофобное прикрепление и электростатическую адгезию на желатине, поли-L-лизине, Cell-Tak или Vectabond. Результаты у разных штаммов различались. Данных АСМ высокого разрешения по гладкому E. coli с полноразмерным О-антигеном не было, а АСМ живой Pseudomonas aeruginosa оказалась неудачной.
Авторы сравнили Vectabond (электростатическое прикрепление), глутаральдегид и лектины, связывающие сахара ЛПС. Гладкий E. coli K-12 MG1655, у которого О-антиген восстановили исправлением мутации wbbL, плохо адсорбировался на Vectabond. Глутаральдегид на стекле образует основание Шиффа с первичными аминами лизинов на поверхности клетки, и эта связь обратима в присутствии воды. Жизнеспособность оценивали по окраске SYTOX в комбинированной установке АСМ и флуоресцентной микроскопии. На покровном стекле с глутаральдегидом растущую клетку E. coli снимали в среде LB в течение 24 мин, а деление наблюдали на 27–33 мин.
Что показали изображения
Авторы снимали E. coli как с О-антигеном, так и полностью без олигосахаридов ЛПС. Они сообщают, что контраст АСМ зависит от сложности ЛПС, а ранее наблюдавшиеся домены внешней мембраны представляют собой острова, обогащённые ЛПС nature.com
Nature Communicationsnature.comОткрыть источник ↗.
Также сняты внешние мембраны Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii. В них нет характерных белковых тримеров, которые видны у модельного E. coli.
Авторы описывают и зависящие от фазы роста изменения на полюсах E. coli. Сети тримеров, типичные для клеток экспоненциальной фазы, не разрешались, и появлялись морфологические дефекты. Все эксперименты выполнены на лабораторных культурах бактерий.
