Лектиновый микрочип определил гликаны интактных терапевтических антител, как и масс-спектрометрия

Исследователи оценили лектиновый микрочип второго поколения для профилирования гликанов непосредственно на интактных терапевтических моноклональных антителах, говорится в статье в AAPS Open. Профили гликанов, полученные на чипе, хорошо согласуются с масс-спектрометрией высвобожденных гликанов, сообщают авторы biomedcentral.comAAPS Openbiomedcentral.comОткрыть источник ↗. N-связанное гликозилирование — критический атрибут качества терапевтических антител, влияющий на эффективность, безопасность и фармакокинетику.

Как устроен лектиновый микрочип

Платформа LecChip-IgG-mAb несёт девять специально подобранных лектинов, напечатанных в трёх повторах в 14 лунках. Она нацелена на девять гликановых эпитопов, часто встречающихся в одобренных антителах: коровый фукозил, концевой N-ацетилглюкозамин, концевую бета-галактозу, высокоманнозные структуры, концевую альфа-галактозу, концевую альфа-2,3-связанную N-ацетилнейраминовую кислоту, концевую альфа-2,6-связанную N-гликолилнейраминовую кислоту, триантенные структуры и бисектинг N-ацетилглюкозамин. Один гликан может нести несколько эпитопов, а один эпитоп встречается в нескольких сосуществующих гликоформах, поэтому сигнал отражает суммарное присутствие эпитопа. Благодаря этому результат полуколичественный.

Чип анализирует целый белок без химического или ферментативного отщепления гликанов и требует один микрограмм антитела. Традиционная схема включает отщепление гликанов PNGase F, флуоресцентную метку, разделение гидрофильной хроматографией и идентификацию масс-спектрометрией; даже быстрые протоколы расходуют до 15 микрограммов антитела, а одна инъекция может длиться до часа. Детекция флуоресценции в затухающем поле возбуждает только флуорофоры, связанные с лектинами на поверхности чипа, поэтому после инкубации промывка не нужна.

Проверка на анти-HER2 антителах и адалимумабе

Для проверки авторы получили анти-HER2 антитела с последовательностью трастузумаба в клетках HEK293T. Хемоферментная гликоинженерия дала восемь вариантов гликоформ: Ab-G0, Ab-G0F, две формы Ab-G1F (с галактозой на 3-м и 6-м плече), Ab-G2, Ab-G2F, Ab-S2G2 и Ab-S2G2F biomedcentral.comAAPS Openbiomedcentral.comОткрыть источник ↗. MALDI-TOF-анализ высвобожденных гликанов показал, что Ab-G0, Ab-G0F, Ab-G2 и Ab-G2F полностью гомогенны. Препараты G1F содержали 12,2 и 0,1 процента остаточного G0F. Сиалилированные варианты частично потеряли сиаловые кислоты при транспортировке и хранении: осталось 70,4 процента S2G2 и 64,4 процента S2G2F.

Интактные антитела, меченные Cy3, разводили до 125 нанограммов на миллилитр, инкубировали на чипе в течение ночи и считывали на GlycoStation Reader 2300. По данным авторов, оба подхода дали близкие результаты, а дополнительные эксперименты подтвердили динамический диапазон и промежуточную прецизионность платформы. Чип также проверили на трёх сериях референсного препарата адалимумаба Humira и восьми биосимиляров. По мнению авторов, это подтвердило его пригодность как дополнительного инструмента для характеризации терапевтических антител.