В КНР разработали метод Msc-RRBS для анализа метилирования ДНК одиночных клеток

Исследователи из Института физических наук Хэфэя при Академии наук Китая разработали протокол мультиплексного бисульфитного секвенирования с уменьшенным представительством для единичных клеток — Msc-RRBS. Методика предназначена для параллельного полногеномного анализа профилей метилирования ДНК сотен отдельных клеток, пулов клеток или субнанограммовых количеств очищенной геномной ДНК. Полный рабочий процесс от сортировки клеток до готовых библиотек секвенирования и первичного анализа занимает около шести дней для одного или нескольких 96-луночных планшетов, сообщили авторы в журнале Nature Protocols nature.comNature Protocolsnature.comОткрыть источник ↗.

Реакции в одной лунке и мультиплексирование

Классический метод RRBS фиксирует усредненный уровень эпигенетических меток клеточной популяции, скрывая гетерогенность между отдельными клетками. При анализе единичных клеток ключевой проблемой остаются потери малого количества биоматериала при многократных переносах между пробирками и смене буферных растворов. В методике Msc-RRBS лизис клеток, рестрикция, репарация концов и лигирование адаптеров проводятся последовательно в одной микролунке без смены буфера.

Использование коротких индексированных адаптеров подавляет образование адаптерных димеров и позволяет очищать библиотечную ДНК с помощью магнитных частиц. Молекулярное штрихкодирование дает возможность объединять по 24 образца одиночных клеток в общий пул перед дальнейшей обработкой, что сокращает расход реактивов. Для первичной обработки данных, расчета метрик качества и картирования метилирования авторы создали конвейер SingleCellMethPipe.

Апробация на стволовых клетках крови

Работоспособность протокола авторы проверили на 96 стволовых и прогениторных клетках кроветворения, полученных от здорового донора и пациента с миелодиспластическим синдромом. Согласно исследованию, контроль качества прошли 86 библиотек, что составило 89,6% успешных выходов nature.comNature Protocolsnature.comОткрыть источник ↗.

Полученные данные позволили выявить эпигенетические различия между типами клеток, а также между здоровым образцом и клетками с патологией кроветворения. Экспериментальная часть методики требует стандартных навыков молекулярной биологии, а базовый анализ данных выполняется без углубленной биоинформатической подготовки.